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細胞凋亡（apoptosis）也稱為程序性細胞死亡（programmed cell death），在多個信號通路的參與下，是一個高度受控的過程。細胞凋亡不僅可以去除機體不再需要的、多余的細胞和組織，使機體正常生長和發育，而且還能殺死過剩的免疫細胞和受到病毒感染或出現DNA損傷的細胞，最大限度地減少這些細胞對機體的威脅。

區別于損傷導致的細胞壞死，凋亡細胞的形態學特征為核染色質凝聚、細胞皺縮，以及膜結合的凋亡小體的產生，還會出現DNA片段化和多種胞內蛋白的分解或降解。

檢測細胞凋亡的方法有很多，有根據凋亡細胞固有的形態特征，利用光學顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡等來觀察細胞形態；也有根據細胞凋亡過程中的時相變化檢測是否發生凋亡，常見的有Caspase活性檢測、Annexin V檢測、線粒體膜電位檢測、TUNEL檢測等。細胞發生凋亡時，不同區域內（如細胞膜、細胞漿、線粒體、細胞核等）會發生不同的生理生化改變。因此，針對不同區域的細胞凋亡檢測要采用不同的方法。

細胞凋亡有個典型特征是線粒體活性受損，包括膜電位和線粒體氧化還原能力的改變。發生這些的主要原因是線粒體膜通透性轉換孔的打開，引起離子和小分子的進出和細胞色素c的釋放。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。正常生理狀態下，線粒體負電性高，JC-1進入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強，細胞凋亡時，線粒體去極化產生，負電性降低，JC-1則以單體存在細胞質，綠色熒光增強。

這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。

線粒體膜電位探針JC-1 染料

JC-1 染料法檢測線粒體膜電位變化

細胞膜在整個細胞凋亡過程中都會持續發生變化。細胞膜變形或起泡發生在細胞凋亡早期，隨著細胞凋亡的進展，細胞膜脂質成分和完整性也會發生變化。例如，磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞質膜的內部小葉外翻到外部小葉上，進而暴露在細胞外部環境中。

凋亡細胞質膜上PS的外翻

Annexin Ⅴ是一種分子量為35-36kD的Ca依賴性磷脂結合蛋白，正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS, 而活細胞的PS位于細胞膜的內表面，無法與Annexin V特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexin V鑒別凋亡細胞和活細胞。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒標記后可以使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS, 所以Annexin V無法區分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內的DNA結合，區分壞死細胞和活細胞。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整， PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發后會發射紅熒光，被相應通道接收。所以Annexin V和PI同時使用，就可以區分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。

Q1：左上象限（UL）為（Annexin V-/PI+），可能是已經沒有細胞膜的細胞碎片，或者其他原因導致的死亡細胞；

Q2：左下象限（LL）為正常（活）細胞（Annexin V-/PI-）；

Q3：右上象限（UR）為晚期凋亡細胞（Annexin V+/PI+）；

Q4：右下象限（LR）為早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）。

半胱天冬酶（Caspase）活化是細胞凋亡早期的重要信號。半胱天冬酶屬于半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是細胞凋亡相關的復雜細胞過程的關鍵調節因子。絕大多數情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的最終執行者 Caspase-3 上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被激活，并執行最后的凋亡程序。因此可以通過檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應細胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測細胞凋亡。

半胱天冬酶活性檢測試劑盒SuperViewTM 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells

細胞凋亡過程中細胞核形態變化的特征是DNA鏈斷裂、DNA片段化、核膜降解和細胞核起泡、產生微核。

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和熒光素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，稱為TUNEL法。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL是檢測DNA片段化（細胞凋亡）的最常用方法。

TUNEL 法檢測苦參堿刺激下 HepG2 細胞凋亡情況

TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記。是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

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