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線粒體是動(dòng)植物細(xì)胞生成ATP的主要地點(diǎn)，是促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換、參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。線粒體在呼吸氧化過程中，將所產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢(shì)能儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)膜兩側(cè)造成質(zhì)子及其他離子濃度的不對(duì)稱分布而形成線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)。正常的MMP是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能。

線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)

線粒體是細(xì)胞能量和新陳代謝的重要調(diào)節(jié)者，對(duì)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活起著至關(guān)重要的作用。線粒體的核心功能是通過氧化磷酸化合成ATP，這就是眾所周知的線粒體生物能量學(xué)。而ATP的產(chǎn)生，是與線粒體膜電位有關(guān)的。線粒體通過由電子傳遞鏈產(chǎn)生的膜電位梯度來(lái)維持氧化磷酸化，從而驅(qū)動(dòng)ATP的合成。這一步是通過位于線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子泵完成的，質(zhì)子泵可以將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子（H+）泵入膜間隙，質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)使線粒體膜間隙積累大量質(zhì)子，形成跨線粒體內(nèi)膜的跨膜電位，即線粒體膜電位。當(dāng)質(zhì)子返回時(shí)便推動(dòng)生命體最重要的能量貨幣ATP的產(chǎn)生，人體的ATP有95%為線粒體所提供。

正常情況下，線粒體內(nèi)膜電位較高，保持在負(fù)電位，而外膜電位較低，保持在正電位。當(dāng)某些因素導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞過程障礙，影響基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子（H+）跨膜梯度的形成，就會(huì)導(dǎo)致外正、內(nèi)負(fù)的線粒體膜電位下降，即去極化。大量研究表明，線粒體膜電位下降與自噬、凋亡或壞死等有關(guān)。線粒體膜電位功能障礙，甚至細(xì)微的異常變化，都可能極大地影響細(xì)胞內(nèi)的生物活性，引起各種疾病（阿爾茨海默病、糖尿病和癌癥等）。

線粒體膜電位示意圖

因此，線粒體膜電位是評(píng)價(jià)線粒體正常功能的重要指標(biāo)之一，不僅反映了線粒體功能的完整性，對(duì)ATP的合成、離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控以及抗氧化作用都具有重要的影響，同時(shí)也反映了細(xì)胞的健康狀況，對(duì)細(xì)胞的生存和發(fā)展具有重要的意義。另外，檢測(cè)線粒體膜電位的變化對(duì)生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷也具有重要意義。所以，我們應(yīng)該重視線粒體膜電位的變化，并采取相應(yīng)的措施來(lái)保護(hù)線粒體的正常功能。

JC-1 是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較低時(shí)，JC - 1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC - 1 為單體，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 527 nm，可以產(chǎn)生綠色熒光；在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，可以產(chǎn)生紅色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。

JC-1進(jìn)入線粒體和聚集物生成的示意圖

Rhodamine 123 是一種可透過細(xì)胞膜的陽(yáng)離子綠色熒光染料，可作為線粒體膜電位的指示劑，其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度弱。而在凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，引起線粒體膜電位的降低，Rhodamine 123 重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光，廣泛用作檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，并且對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性。

TMRM（四甲基羅丹明甲酯）/TMRE （四甲基羅丹明乙酯）是一種陽(yáng)離子細(xì)胞滲透型熒光染料，易與活躍的線粒體螯合，是可用能斯特方程定量測(cè)量膜電位的優(yōu)選染料。染料不會(huì)在細(xì)胞膜中形成聚集體，并且與膜蛋白具有最小的相互作用。因此，根據(jù)能斯特方程，染料的跨膜分布與膜電位直接相關(guān)。

它們除了可以選擇性的對(duì)線粒體進(jìn)行染色外，與JC-1一樣，TMRM和TMRE也廣泛地用于線粒體膜電位的測(cè)定。這兩種特殊的羅丹明酯將線粒體染色，帶有橙色熒光。它們的光譜特征與TRITC相似，這是TMRM和TMRE使用起來(lái)非常方便。TMRE的疏水性比TMRM略微強(qiáng)一點(diǎn)。

MitoScene TM Red CMXRos 是一種紅色熒光染料，含有氯甲基官能團(tuán)，可標(biāo)記線粒體。只需與活細(xì)胞簡(jiǎn)單孵育即可被動(dòng)運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜并直接聚集在活性線粒體上，該染料的積累取決于膜電位的高低。一旦線粒體被染色后，還可根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求用醛類固定劑進(jìn)行固定。對(duì)于免疫組化及原位雜交實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞需先經(jīng)過透化，MitoScene TM Red CMXRos 還可染色透化細(xì)胞的線粒體。該染料適合雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，其紅色熒光與其他的綠色熒光探針可以很好的區(qū)分開來(lái)?？梢匀舅兰?xì)胞。

4-Di-1-ASP 是苯乙烯基染料，用于染色活細(xì)胞線粒體。它也被用于染色神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、活體大腦組織等。在顯微鏡成像時(shí)可發(fā)出綠色熒光 (λex /λem = 475/606 nm)。

DASPEI 是一種苯乙烯基染料，可以染色活細(xì)胞的線粒體。DASPEI 的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)在 550/573 nm，熒光壽命強(qiáng)，靈敏度高。DASPEI 可以對(duì)活細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行染色，具有良好的標(biāo)記性，也可獨(dú)立于神經(jīng)元活性用于突觸前神經(jīng)末節(jié)的染色。

MitoSceneTM Green I是一種線粒體綠色熒光染料，可在納摩爾水平對(duì)線粒體進(jìn)行染色標(biāo)記，該染料具有質(zhì)膜透性，且在線粒體膜上積累而呈現(xiàn)明亮的熒光。該染料在線粒體中的定位不依賴于線粒體膜電位，染色固定細(xì)胞信噪比不理想，在細(xì)胞固定、透化之后，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱或丟失，所以我們推薦只用來(lái)染活細(xì)胞。

10-壬基吖啶橙（NAO）是吖啶橙的衍生物， 是一種用于完整細(xì)胞內(nèi)線粒體特異性熒光標(biāo)記物。與Rh123相比，細(xì)胞中NAO的積聚與質(zhì)子動(dòng)力驅(qū)動(dòng)關(guān)系不大，但是與線粒體相關(guān)膜蛋白或者脂類發(fā)生作用相關(guān)。NAO的攝入不依賴于線粒體跨膜電勢(shì)差，可用于檢測(cè)線粒體。NAO可與心磷脂等帶負(fù)電荷磷脂特異性結(jié)合， 其與線粒體膜的相互作用不依賴于線粒體的膜電位；分析細(xì)胞凋亡時(shí)， 可用羅丹明123來(lái)檢測(cè)線粒體的膜電位， 而用NAO來(lái)檢測(cè)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。NAO和羅丹明123（Rh123）是研究線粒體功能一對(duì)好的染料。